概述
网络毒理学（Network Toxicology）是网络药理学在毒理学领域的延伸，于2011年由刘昌孝院士等首次提出。它结合生物信息学、大数据与多组学技术，通过构建“毒物-靶点-通路-疾病”的多层次网络，系统揭示环境污染物、化学物质、食品添加剂等毒物对人体的毒性作用机制，并用于预测毒性和评估安全性。
核心分析思路和流程
网络毒理学的分析框架与网络药理学高度相似，核心在于“预测-关联-验证”
经典分析流程：
1、毒物与疾病靶点获取：从CTD（比较毒理基因组学数据库）、PubChem、Swiss Target Prediction等数据库获取毒物的作用靶点，以及疾病的相关靶基因，取交集得到潜在毒性靶点。
2、PPI网络构建与核心靶点筛选：利用STRING数据库构建蛋白质互作网络（PPI），通过Cytoscape软件及拓扑算法（如Degree、Betweenness）筛选核心枢纽基因（Hub genes）。
3、功能富集与通路分析：对交集靶点进行GO（基因本体）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）富集分析，从宏观层面解析毒物致病的生物学机制。
4、分子对接验证：使用AutoDock Vina等软件进行分子对接，模拟毒物分子与核心靶蛋白的结合亲和力，验证预测结果的可靠性。
进阶分析思路（提升文章深度）：
1、结合机器学习（ML）：引入LASSO回归、随机森林（RF）、XGBoost等算法筛选关键基因，构建预测模型，并通过SHAP值进行可解释性分析，提升核心靶点筛选的准确性。
2、结合多组学数据：整合转录组（RNA-seq）、单细胞测序、代谢组等数据，对预测的核心靶点进行表达验证和机制解析，实现“计算预测+组学验证”的交叉验证。
3、结合流行病学数据：整合NHANES（美国国家健康与营养调查）等真实世界人群数据，验证“毒物暴露-疾病风险”的宏观关联，形成“人群证据-分子机制”的闭环。
4、结合孟德尔随机化（MR）：利用遗传变异作为工具变量，在观察性数据中推断“毒物暴露-疾病”的因果关系，弥补传统关联分析的不足。
5、结合实验验证：通过体外（细胞实验）或体内（动物实验）功能验证，对预测的核心靶点和通路进行“实锤”验证，形成“预测-验证”的完整逻辑闭环。
网络毒理学常见毒物
一、微纳米塑料类 (Micro- and Nanoplastics, MNPs)
微纳米塑料是尺寸小于5毫米的塑料颗粒，其中纳米塑料粒径甚至不足100纳米，主要来自塑料制品的降解，常见成分有聚苯乙烯（PS）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）等。 微小的尺寸能让它穿透细胞膜、血脑屏障甚至胎盘屏障，在肝脏、肾脏、神经系统等器官积累，引发肝肾毒性、神经毒性、生殖发育毒性等问题。更关键的是，它还能吸附环境中的重金属、持久性有机污染物（POPs）和病原体，形成“载体效应”，把多种有害物质一同带入体内，产生更复杂的联合毒性。
二、增塑剂 (Plasticizers)
增塑剂是塑料制品中常用的化学物质，目的是增加材料的柔韧性，主要分为传统增塑剂和新型/替代增塑剂两类。
1.、邻苯二甲酸酯类 (Phthalic Acid Esters, PAEs)
这是应用最广泛的传统增塑剂，常见的有邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯（DEHP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二甲酯（DMP）等。
2.、新型/替代增塑剂
为了降低PAEs的健康风险，乙酰柠檬酸三丁酯（ATBC）、1,2-环己烷二甲酸二异壬酯（DINCH）、对苯二甲酸二辛酯（DOTP）等新型替代品应运而生。虽然它们被认为毒性较低，但长期的环境行为和潜在健康效应，仍需要进一步深入研究。
三、阻燃剂 (Flame Retardants)
阻燃剂用于抑制或延缓材料燃烧，广泛应用于电子产品、建筑材料、纺织品等，主要分为溴化阻燃剂和有机磷/芳基磷酸酯阻燃剂。
1、溴化阻燃剂 (Brominated Flame Retardants, BFRs)
多溴联苯醚（PBDEs）（含BDE-47）、四溴双酚A（TBBPA）、十溴二苯乙烷等都属于这类，它们具有持久性、生物累积性和毒性，是常见的环境污染物。它有神经毒性，可能影响儿童智力发育；还会干扰甲状腺功能，且容易在人体脂肪组织中蓄积，通过食物链不断放大危害。
2、有机磷/芳基磷酸酯阻燃剂 (Organophosphate Flame Retardants, OPFRs)
作为溴化阻燃剂的替代品，磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯（TDCPP）、磷酸三丁氧基乙基酯（TBP）、磷酸三苯酯等使用量逐渐增加。但它同样有潜在健康风险，可能引发神经毒性、内分泌干扰和生殖毒性。
四、全氟化合物 (Per- and Polyfluoroalkyl Substances, PFAS)
全氟化合物是人工合成的有机氟化物，因疏水疏油的特性，广泛用于不粘涂层、防水纺织品、消防泡沫等，常见的有全氟辛烷磺酸（PFOS）、全氟辛酸（PFOA）、全氟己烷磺酸、全氟壬酸（PFNA）等。 它被称为“永久化学品”，化学稳定性极强，难以在环境和生物体内降解，会长期积累。其毒性主要体现在免疫毒性（如降低疫苗反应）、肝脏毒性、生殖发育毒性，还具有潜在致癌性。
五、双酚类化合物 (Bisphenols)
双酚类化合物具有内分泌干扰活性，广泛用于塑料制造（如聚碳酸酯）和环氧树脂，其中双酚A（BPA）研究最深入。随着BPA被限制使用，双酚S（BPS）、双酚F（BPF）、双酚B（BPB）等替代品逐渐增多。 这类物质是典型的环境内分泌干扰物，能模拟或拮抗体内雌激素，干扰生殖系统、神经系统和代谢功能，对发育中的生物体（如胎儿、婴幼儿）影响更为显著。
六、重金属及类金属
重金属和类金属是环境中常见的有毒元素，不易降解，易在生物体内累积，对健康危害严重。
1、重金属
铅（Pb）、镉（Cd）、汞（Hg）、钴（Co）、铜（Cu）等都属于有毒重金属，具有多器官毒性：铅和汞主要损害神经系统，镉主要影响肾脏和骨骼，长期低剂量暴露会导致慢性中毒，且它们在体内半衰期长，难以排出。
2、类金属
砷（As）是典型的类金属，其中无机砷毒性最强。砷暴露与皮肤病变、神经系统损害、心血管疾病及多种癌症相关，妊娠期暴露还会影响胎儿发育，中药材中的砷残留也需要重点关注。
七、农药类 (Pesticides)
农药用于防治农业病虫害，根据用途和化学结构，主要分为除草剂、有机磷农药、拟除虫菊酯类等。
1、除草剂
草甘膦、阿特拉津（莠去津）、2,4-D等是常见除草剂，暴露后可能引发内分泌干扰、生殖毒性，还存在潜在致癌风险。
2、有机磷农药
甲基对硫磷、甲拌磷等属于这类，神经毒性极强，通过抑制乙酰胆碱酯酶导致神经系统功能紊乱，严重时可致人死亡。
3、拟除虫菊酯类
氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、联苯菊酯、氯菊酯等是常见代表，同样有神经毒性，但在哺乳动物体内代谢较快，急性毒性相对较低。
八、多环芳烃 (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs) 及衍生物
多环芳烃是煤、石油、天然气等有机物不完全燃烧的产物，广泛存在于大气、土壤和水中，苯并[a]芘（BaP）、苯并[a]蒽是毒性最强的代表。 它具有强致癌性、致突变性和致畸性，毒性主要通过代谢活化产生DNA加合物，进而引发细胞损伤和癌变。
九、持久性有机污染物 (Persistent Organic Pollutants, POPs)
持久性有机污染物是一类具有环境持久性、生物累积性、半挥发性和远距离迁移能力的有毒化学物质。主要包括二噁英、多氯联苯（PCBs）和有机氯农药（如DDT）。 POPs对人类和野生生物的健康构成严重威胁，可导致免疫系统抑制、生殖发育障碍、神经毒性以及多种癌症。
十、食品相关污染物
食品相关污染物是指在食品生产、加工、储存过程中引入或产生的有害物质，包括食品添加剂、防腐剂和热加工产物等。
1、食品添加剂与防腐剂
人工食用色素、人工甜味剂（如阿斯巴甜、糖精、安赛蜜）、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、尼泊金酯类（如尼泊金甲酯、尼泊金丙酯）等是常见代表。虽然规定剂量内使用通常被认为安全，但长期过量摄入或多种添加剂联合作用，可能导致肠道菌群紊乱、过敏反应，甚至潜在致癌风险。
2、热加工/污染产物
丙烯酰胺是富含淀粉的食物在高温烹饪（油炸、烘焙）过程中产生的潜在致癌物；5-羟甲基-2-糠醛（HMF）是糖类热处理过程中产生的化合物，过量摄入对健康不利。
十一、大气/环境空气污染物
大气污染物是存在于大气中并危害人体健康的物质，主要包括细颗粒物（PM2.5）、挥发性有机物（VOCs）（如甲醛、1,3-丁二烯）等。 这些污染物可导致呼吸系统损伤、心血管疾病、系统性炎症反应，并增加癌症风险。
十二、日化/个人护理品污染物 (Personal Care Products, PCPs)
日化/个人护理品污染物存在于化妆品、洗涤用品、香水等产品中，可能通过皮肤接触、吸入或废水排放进入环境。
• 对苯二胺类（染发剂成分）：易引发皮肤过敏、接触性皮炎，存在潜在致癌风险；
• 二苯甲酮-3、甲氧基肉桂酸辛酯（防晒剂）：属于内分泌干扰物，影响激素平衡；
• 三氯生、三氯卡班（抗菌成分）：长期使用可能导致细菌耐药性，对水生生态系统有毒性。 这类物质中的许多属于新兴污染物（PPCPs），其环境行为与毒理效应备受关注。
十三、酚类/烷基酚类内分泌干扰物
酚类和烷基酚类内分泌干扰物（EDCs）能模拟或干扰人体激素作用，壬基酚（Nonylphenol, NP）和4-壬基酚是典型代表。 它具有明确的雌激素活性，严重干扰内分泌系统，尤其对水生生物和人类的生殖系统、神经系统、免疫系统发育不利，还可能促进肥胖，多国已限制其使用。
十四、霉菌毒素 (Mycotoxins)
霉菌毒素是真菌（霉菌）产生的次级代谢产物，毒性显著。
• 黄曲霉毒素B1（AFB1）：已知最强的致癌物之一，毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍，1毫克即可诱发癌症，通过受污染谷物、坚果进入人体，可致急慢性中毒，严重时引发肝癌甚至死亡；
• 赭曲霉毒素A：具有肾毒性、免疫抑制性和致癌性，影响胎儿发育；
• 玉米赤霉烯酮：主要表现为雌激素样作用，干扰生殖系统。
十五、烟草/烟类污染物
烟草及烟类产品含多种有害物质，传统香烟烟雾和二手烟中含有尼古丁、焦油、一氧化碳及多环芳烃、亚硝胺、重金属铅/汞等致癌物，可导致呼吸道疾病、心血管疾病、肺癌、口腔癌等多种癌症及神经系统损害，尼古丁具有强成瘾性。电子烟气溶胶含尼古丁、重金属（铅、镍、镉等）、挥发性有机物（甲醛、乙醛、苯等），对呼吸系统、心血管系统有潜在危害，还可能引发肺损伤，其二手烟也含多种有毒有害物质。
十六、轮胎/特征环境污染物
轮胎磨损颗粒是微塑料重要来源，含多种化学添加剂，N-(1,3-二甲基丁基)-N’-苯基对苯二胺（6PPD）是常用抗氧化剂，可防止橡胶老化。 6PPD在环境中降解为6PPD-醌（6PPD-Q），对水生生物（尤其鲑鱼）急性致死性极强，极低浓度即可致鱼类大量死亡；还能影响斑马鱼行为、致器官畸形，可通过吸入、饮食、皮肤接触等进入人体，引发消化系统、神经系统、免疫系统等多器官毒性，甚至慢性肝损伤。
十七、其他环境/工业污染物
这类污染物涵盖范围广，包括药品和个人护理品（PPCPs）、三甲胺N-氧化物（TMAO）、六氟环氧丙烷二聚酸（HFPO-DA，GenX）等。
• PPCPs：作为新兴污染物，低浓度下可能对非目标生物产生慢性影响，干扰人体内分泌，尤其威胁婴幼儿健康；
• TMAO：与心血管疾病风险相关，高浓度可能增加心肌梗塞、中风风险，与结直肠癌、高血压人群中风风险升高有关；
• HFPO-DA：全氟化合物替代品，可干扰斑马鱼胚胎脂质代谢、改变HPT轴基因表达，导致神经发育紊乱。
十八、药物、中药及强毒性物质
1、药物
部分药物不当使用、过量摄入或个体敏感时会产生毒性：
• 氨甲环酸：副作用相对小，长期使用需监测视力，少数情况引发颅内血栓、大出血或中枢神经症状；
• 阿霉素：化疗药物，副作用包括脱发、骨髓抑制、恶心呕吐、口腔炎，严重时致心脏毒性、扩张型心肌病；
• 双氯芬酸：非甾体抗炎药，常见胃肠道不适，严重时致溃疡、出血、穿孔，儿童服用易引发血尿；
• 阿米替林：抗抑郁药，副作用有口干、嗜睡、头晕、便秘，严重时引发心律不齐、低血压、癫痫发作；
• 华法林：抗凝血药，主要副作用为出血（牙龈出血、消化道出血等），过量可危及生命；
• 金刚烷胺：抗病毒药（也用于帕金森病），引发消化道、中枢神经症状（头晕、失眠、恶心、幻觉），可能导致皮肤网状青斑；
• 帕唑帕尼：靶向抗癌药，常见腹泻、疲劳、恶心呕吐、高血压、肝功能异常，严重时引发心脏问题、出血、肝损伤，需严格遵医嘱。
2、有毒中药/天然毒物
• 巴豆霜：巴豆炮制品，含巴豆毒素，抑制蛋白质合成、损伤消化道黏膜，引发恶心呕吐、剧烈腹泻，高剂量致呼吸、循环衰竭死亡；
• 斑蝥素：斑蝥主要有毒成分，30毫克即可致人死亡，强皮肤刺激性，具肾毒性，引发多器官毒性；
• 马兜铃酸：I类致癌物，具强肾毒性和致癌性，与肾衰竭、泌尿道癌症相关；
• 鹅膏毒肽、槟榔碱、丁香酚类、甲基丁香酚等：天然毒物，使用不当或误食可致严重中毒甚至死亡。
3. 成瘾/管制物质
• 四氢大麻酚（THC）：大麻主要精神活性成分，具成瘾性，导致记忆认知减退、焦虑抑郁、多疑，长期使用引发免疫力降低、不孕症，可能致动脉粥样硬化、阻塞性中风；
• 毒品混合物：相互作用可能增强毒性，引发中枢兴奋、致幻、抑制等精神症状，导致行为失控、暴力犯罪，戒毒与治疗难度更大。
十九、典型联合暴露污染物
实际生活中人体常同时暴露于多种污染物，联合暴露毒性可能更复杂：
• 全氟辛烷磺酸（PFOS）+微塑料：导致水生生物发育失败、性成熟延迟、生长减缓，引发肝脏、鳃、性腺联合毒性，影响滤食率和抗氧化酶活性；
• 双酚A（BPA）+邻苯二甲酸酯（DEHP）：均为内分泌干扰物，联合作用增强生殖、神经、代谢功能干扰，引发学习记忆障碍，与心血管疾病风险相关；
• 砷+三甲胺N-氧化物（TMAO）：联合作用产生复杂毒性，具体效应需结合暴露剂量与时长分析。
正向网络毒理学典案例解析
题目：Exploring the toxicological impact of bisphenol a exposure on psoriasis through network toxicology, machine learning, and multi-dimensional bioinformatics analysis
单位：遵义医科大学附属医院
期刊：Journal of Environmental Management
影响影子：9.2
分区：JCR Q1，中科院2区
发表时间：2025年6月
研究运用网络毒理学和计算模拟方法，探索双酚A诱导银屑病的潜在靶点和分子机制，鉴定出100个候选靶点。通过机器学习算法，进一步确定了5个核心靶点：PTAFR、CXCR2、MMP9、IDO1和LCK，双酚A可能通过这些靶点加剧银屑病。分子对接和分子动力学模拟证实了双酚A与这些核心靶点之间的稳定相互作用，尤其是PTAFR。此外，文章还构建了一个不良结果途径（AOP）框架，以说明双酚A对银屑病的毒性效应。这些结果表明，环境污染物双酚A可能有加重银屑病的进展，为未来研究提供了基础。
方法与逻辑
1. 靶点收集与筛选：
• 从 PubChem 数据库获取 BPA 的化学结构和 SMILES notation，通过 ChEMBL、STITCH、Swiss Target Prediction 数据库筛选 BPA 相关靶点（物种限定为人类），合并去重得到 BPA 靶点集合。
• 从 OMIM 和 GeneCards 数据库获取银屑病相关疾病靶点，合并去重得到银屑病靶点集合，取两者交集获得 100 个 BPA 诱导银屑病的潜在靶点。
2.功能通路分析：利用 DAVID 数据库对 100 个潜在靶点进行 GO（生物过程、细胞组分、分子功能）和 KEGG 通路富集分析，筛选调整后 p 值 < 0.05 的显著富集通路。
3. 核心靶点筛选：采用 LASSO 回归和支持向量机 - 递归特征消除（SVM-RFE）两种机器学习算法，筛选两者交集作为核心靶点。
4. 核心靶点验证与诊断价值评估：下载 GEO 数据集 GSE13355，分析核心靶点在银屑病皮损组织与正常皮肤组织中的差异表达（p<0.05 为显著差异），通过 ROC 曲线和 AUC 值评估核心靶点的诊断准确性。
5. 免疫浸润分析：使用 GSVA R 包进行单样本基因集富集分析（ssGSEA），探究 21 种免疫细胞在银屑病皮损与正常皮肤中的浸润差异，以及核心靶点与免疫细胞浸润的相关性，采用 Wilcoxon 秩和检验进行统计学分析。
6.分子对接：从 PDB 数据库获取核心靶点蛋白三维结构，从 PubChem 数据库获取 BPA 分子结构，经 Open Babel 格式转换、蛋白预处理（脱水、氢化）后，用 AutoDockTools-1.5.7 进行分子对接，通过 PyMOL 3.2 可视化高结合能的蛋白结构。
7.分子动力学模拟：使用 Gromacs 2022.3 软件对 BPA-PTAFR 复合物进行 100ns 分子动力学模拟，采用 AmberTools 22 处理小分子，通过 MM/GBSA 方法计算结合自由能，分析 RMSD、Rg、SASA、RMSF 及氢键数量等参数评估复合物稳定性。
8. 不良结局路径（AOP）构建：基于靶点表型和基因 - 表型网络，筛选与 BPA 和银屑病高度相关的表型作为关键事件（KEs），相关基因作为分子起始事件（MIEs），结合文献中不同表型的层级和生物学关系，构建 BPA 暴露与银屑病关联的 AOP 框架。
关键结果描述
1、网络毒理学分析双酚A诱导银屑病的潜在靶点
通过网络毒理学方法，研究双酚A在银屑病中的潜在致病效应。从ChEMBL、Swiss Target Prediction和STITCH数据库中识别出189个双酚A靶点，同时从GeneCards和OMIM数据库中获得5292个银屑病相关靶点。通过Venn图分析，发现100个共同靶点，这些靶点被认为是双酚A诱导银屑病的潜在靶点。
2、双酚A诱导银屑病靶点的功能富集分析
对100个重叠靶点基因进行富集分析，以探讨双酚A诱导银屑病的潜在机制，GO富集分析显示，靶点主要在细胞间信号传导、免疫调节和炎症反应中可能发挥作用。KEGG通路富集分析显示，鉴定的靶点主要与“内分泌抵抗”、“PI3K-AKT信号通路”和“趋化因子信号通路”等信号通路等。
3、机器学习识别关键靶点
应用LASSO和SVM算法从100个双酚A诱导的银屑病相关靶点中识别核心靶点基因。通过LASSO逻辑回归，识别出12个潜在核心靶点，SVM回归算法进一步缩小选择范围至5个核心靶点。最终，通过整合两种方法的结果，确定了5个与双酚A诱导银屑病相关的核心靶点：PTAFR、CXCR2、MMP9、IDO1和LCK。
4、核心基因与银屑病中免疫细胞的相关性分析
银屑病皮损组织中活化树突状细胞、M1 巨噬细胞、中性粒细胞、活化 CD4 + 记忆 T 细胞、γδT 细胞等免疫细胞浸润显著增加，调节性 T 细胞、静息肥大细胞浸润显著减少；5 个核心靶点与活化树突状细胞、活化 CD4 + 记忆 T 细胞、γδT 细胞、M1 巨噬细胞等浸润评分呈正相关，与调节性 T 细胞、静息肥大细胞浸润评分呈负相关。
5、双酚A与银屑病靶点的分子对接分析
作为网络毒理学框架的一部分，进行了分子对接分析，以评估双酚A与5个核心靶点蛋白之间的相互作用。双酚A与所有五个靶点（PTAFR、CXCR2、MMP9、IDO1和LCK）均显示出较强的结合亲和力，结合能分别为-8.7、-7.4、-8.0、-7.2和-6.2 kcal/mol。这些值均低于-5 kcal/mol，表明对接指示自发相互作用，其中 BPA 与 PTAFR 的结合能最低（-8.7 kcal/mol），结合能力最强。
6、分子动力学模拟与结合自由能评估
尽管分子对接分析采用了半柔性对接方法，但它无法考虑蛋白质结构的灵活性、温度、压力和溶剂效应。为了进一步探索蛋白质-配体相互作用的稳定性，进行了双酚A-血小板激活因子受体（PTAFR）复合物的分子动力学（MD）模拟，BPA-PTAFR 复合物的结合自由能为 - 24.02 kcal/mol，RMSD 在 10ns 后稳定在 0.51 nm，Rg 从 2.26 nm 稳定至 2.22 nm，SASA 从 195 nm² 降至 165 nm² 并在 60ns 达到平衡，RMSF 波动较小，氢键数量稳定，表明复合物在生理环境中具有良好的稳定性。
7、构建不良结果途径
基于Villeneuve等人提出的方法，建立了一个新的不良结果途径（AOP）框架。在这个AOP网络中，PTAFR、CXCR2、MMP9、IDO1和LCK的表达和活性可能受双酚A影响。此外，PI3K-AKT和趋化因子信号通路也可能涉及其中，导致皮肤免疫失调和银屑病。本研究通过系统整合上述关键核心基因，成功构建了一个全面的AOP框架，为阐明双酚A加剧银屑病的机制提供了理论基础。
逆向网络毒理学典案例解析
题目：Multi-omics integrative analysis of the mechanismslinking environmental pollutant exposure to bladdercancer pathogenesis
单位：南充市川北医学院
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
影响影子：6.6
分区：JCR Q1，中科院1区
发表时间：2025年10月
研究聚焦环境污染物暴露与膀胱癌发病机制的关联，通过多组学整合分析，系统解析环境-基因互作网络，识别关键因果基因及高风险污染物，系统揭示了环境污染物暴露与膀胱癌（BCa）发病机制的关联，识别了关键因果枢纽基因及高风险污染物，建立了“环境污染物暴露-基因相互作用-膀胱癌发生”的完整证据链，为环境相关BCa的分子分型及精准预防提供了新生物标志物和干预靶点。
方法与逻辑
1、数据整合：整合多队列膀胱癌转录组数据与CTD基因-化学-疾病网络，筛选环境响应性差异表达基因（DEGs）。
2、因果推断：通过MR、SMR及共定位分析，从DEGs中筛选与BCa因果关联的枢纽基因。
3、污染物关联：分析枢纽基因与高风险环境污染物（34种）的关联，并通过分子对接验证基因-污染物结合亲和力。
4、功能验证：利用scRNA-seq及HPA数据库，验证枢纽基因在膀胱组织中的特异性表达模式。
关键结果描述
1、膀胱癌转录组差异基因
运用 limma 包校正批次效应后完成多队列肿瘤与正常样本差异基因筛选，通过火山图直观展示 GSE13507、合并 Meta 队列、TCGA 三组数据集基因 log2FC 与显著性分布，再借助韦恩图统计三组共有的上调、下调差异基因数量，最后绘制交集差异基因与 CTD 数据库膀胱癌相关基因的重叠韦恩图，筛选得到 168 个环境敏感候选靶基因
2、差异基因差异基因 GO/KEGG 富集及 PPI 网络分析
对 168 个候选环境响应差异基因开展功能富集与互作分析，依托 STRING、Metascape 数据库完成 GO 生物学过程、KEGG 信号通路富集，以柱状图展示排名靠前的富集条目、气泡图结合基因数量与 FDR 值可视化富集程度，同时构建靶基因蛋白互作（PPI）网络，阐明候选基因主要参与细胞周期调控、细胞黏附、胞外基质重塑等与膀胱癌发生相关的生物学过程。
3、MR、SMR 与共定位分析验证核心致病基因因果关联
整合孟德尔随机化 MR、SMR 及共定位分析的因果推断结果，采用 IVW、Wald ratio 法完成 MR 分析并以森林图展示 8 个候选基因与膀胱癌的因果效应 OR 值及 PP.H4 共定位后验概率；配套 SMR 效应图、位点图、locuscomparer 共定位图，验证 CTSK、GSTM5、PAFAH1B3 三个基因 PP.H4＞0.70，同时通过 MR-PRESSO、HEIDI 检验排除多效性干扰，夯实三者与膀胱癌发病的因果关联证据。
4、核心基因蛋白互作网络与生物学功能富集分析
利用 GeneMANIA 数据库构建 CTSK、GSTM5、PAFAH1B3 的蛋白互作 PPI 网络，同时对网络内基因开展功能注释富集分析，以条形图展示核心基因簇显著富集的生物学功能，包括谷胱甘肽代谢、寡肽结合、异源物质解毒、溶酶体代谢等，解释三类核心基因在毒素代谢、胞外基质降解中的生理功能。
5、单细胞测序解析核心基因的细胞特异性表达模
单细胞RNA测序数据集完成细胞亚群解析，绘制 UMAP 聚类图、细胞标记基因点图；通过小提琴图、表达点图对比正常与肿瘤组织中不同细胞亚群内核心基因表达水平，证实 CTSK、GSTM5 主要在成纤维细胞低表达，PAFAH1B3 特异性在上皮细胞高表达，明确核心基因发挥作用的细胞微环境。
6、高危环境污染物与核心基因调控网络及结合能热图
从CTD 毒理数据库筛选调控核心基因的高危污染物，构建基因-污染物互作网络，以桑基图直观呈现双酚 A、亚砷酸钠、TCDD 等 34 种污染物对抑癌基因 CTSK、GSTM5 的下调作用及对致癌基因 PAFAH1B3 的上调作用；通过分子对接自由结合能绘制热图，量化各类污染物与三种靶蛋白的结合强度，筛选出结合能≤-5.0 kJ/mol 的高风险污染物。
7、双酚 A、TCDD 与核心靶蛋白分子对接
为分子对接可视化结果，采用 AutoDock Vina 完成小分子污染物与靶蛋白对接，借助 PyMOL 软件处理蛋白晶体结构、去除无关配体与水分子，分别展示双酚 A、TCDD 两种典型污染物与 CTSK、GSTM5、PAFAH1B3 蛋白活性口袋的结合模式，从分子层面直观证实污染物可稳定结合核心蛋白并调控其功能。
7、核心基因免疫组化验证
从 HPA 人类蛋白图谱数据库对核心蛋白的表达水平进行验证，调取膀胱癌正常组织与肿瘤组织免疫组化染色切片，对比 GSTM5、PAFAH1B3 的蛋白染色强度；结果显示GSTM5在肿瘤组织染色显著减弱、PAFAH1B3 在肿瘤组织高染色，从蛋白层面佐证转录组、多组学分析得到的核心基因表达变化规律。
