概述

热点基因集是指与特定生物学过程（如细胞衰老、铁死亡、免疫调控等）或疾病（如肿瘤、自身免疫病等）密切相关的基因集合，这些基因在相关研究中被频繁关注，具有明确的生物学意义，热点基因集生信分析是当前科研中短平快发文的热门方向，其核心思路是依托具有明确生物学意义的现成基因集合，结合公共数据库与多组学技术，快速完成从分子机制到临床价值的研究闭环。

核心分析思路

1、数据获取：从公共数据库（如TCGA、GEO等）获取目标疾病的基因表达数据、临床数据等，同时确定热点基因集（如衰老相关基因、铁死亡相关基因等）。

2、差异表达分析：比较疾病组与对照组之间热点基因集的表达差异，筛选出显著差异表达的基因。

3、功能富集分析：通过GO（基因本体论）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）等数据库，对差异基因进行功能富集分析，揭示其在生物学过程、细胞组分和分子功能等方面的作用。

4、预后分析：结合临床数据，分析热点基因集与患者预后的关系，如生存分析、风险评分模型构建等，评估基因集对疾病预后的预测价值。

5、免疫微环境分析：研究热点基因集与肿瘤免疫微环境的关系，如免疫细胞浸润、免疫检查点分子表达等，探索基因集在免疫调控中的作用。

6、药物预测：基于基因集的表达特征，预测患者对特定药物的敏感性，为临床治疗提供参考。

“热点基因集”经典案例解析

题目：From bioinformatics to bedside: PPBP drives glioblastoma progression under hypoxia via

CXCR2/PI3K/Akt signaling and is targetable by Oenothein B

单位：南京医科大学附属无锡市人民医院

期刊：Cancer Cell International

影响影子：7.0

分区：JCR Q1，中科院3区

发表时间：2026年6月

通过整合TCGA和CGGA等公共数据库，结合缺氧相关基因集（HRGs）和乳酸代谢相关基因集（LMRGs），鉴定了165个候选基因，并基于7个基因（CXCL5、LCN2、IL11、CXCL13、COL5A1、PPBP、FGF17）建立风险评分，成功将患者分为高风险组和低风险组。进一步聚焦PPBP，通过单细胞测序分析揭示其由巨噬细胞和肿瘤细胞自身分泌，并验证其受HIF-1α转录激活，通过CXCR2/PI3K/AKT信号促进肿瘤恶性表型。最后，采用虚拟筛选（KarmaDock + AutoDock）结合SPR实验，从300万小分子中鉴定出天然化合物Oenothein B（月见草素B）可高亲和力结合PPBP，体内外实验证实其抑制肿瘤生长和乳酸代谢。该研究实现了“生信发现-机制解析-药物筛选”的闭环，为GBM提供了新预后标志物和候选药物。

方法与逻辑

1、筛选GBM vs 正常脑组织的差异基因DEGs，与缺氧相关基因HRGs、乳酸代谢基因 LMRGs取交集；

2、基于上面筛选的候选基因做一致性聚类，并分析不同亚型间的生存、免疫浸润、药物敏感性、突变谱的差异；

3、通过PPI网络筛选枢纽基因，并通过单因素Cox回归+LASSO回归进一步筛选核心基因构建预后模型，此外还结合临床指标构建列线图；

4、结合临床组织验证模型基因的表达，对验证结果一致的基因进行单细胞表达定位，并结合公共蛋白数据库HPA进行验证；

5、体外实验验证关键基因的表达和功能，并挖掘潜在分子机制（ChIP、双荧光素酶报告系统、共免疫沉淀（Co-IP）及通路抑制实验）。

6、通过虚拟筛选和表面等离子共振（SPR）识别靶向化合物，并在体外和体内进行药理学验证。

关键结果描述

1、热点基因集共识聚类与亚型生存分析

从公共数据库获取GBM转录组和临床数据，利用DESeq2鉴定GBM与正常组织间的差异表达基因（DEGs），并与缺氧和乳酸代谢基因集取交集，获得165个候选基因，主要富集到了PI3K-Akt信号通路、癌症中的中心碳代谢通路。基于候选基因表达进行共识聚类，将患者分为两个亚型，两亚型间生存、免疫浸润、药物敏感性、突变谱存在显著差异，并进一步分析两亚型间的差异基因及通路富集。

2、预后风险模型构建与验证

  利用LASSO回归从hub基因中确定了7个预后标志物（CXCL5、LCN2、IL11、CXCL13、COL5A1、PPBP、FGF17），构建了7基因预后模型，将患者分为高/低风险组，K-M曲线和ROC曲线证实模型预测效能，并在CGGA外部数据集中验证，高风险组生存期显著更短。

3、预后基因的单细胞转录组分析

单细胞分析注释出6种细胞类型，其中巨噬细胞在肿瘤核心区域含量较高，它们主要存在于肿瘤核心的早期分化阶段。CXCL5在分化早期表达水平较高，而其他预后相关基因在整个分化过程中表达较低。细胞通讯分析显示，小胶质细胞与T细胞之间的相互作用及其相互作用频率显著增加。

4、缺氧环境下 PPBP 促进胶质母细胞瘤细胞恶性表型验证

     收集6对临床GBM及癌旁组织，采用RT-qPCR检测7个预后基因mRNA表达，筛选出显著高表达的PPBP；构建PPBP沉默慢病毒载体转染U87、U251细胞，Westernblot验证敲低效率；设置1%O₂缺氧培养体系，依次开展CCK-8增殖实验、EdU荧光增殖实验、划痕愈合迁移实验、Transwell侵袭实验，并对各项实验结果定量统计，多套细胞功能实验共同证实缺氧下PPBP促进胶质瘤恶性增殖、迁移与侵袭。

5、PPBP调控胶质瘤糖酵解、EMT 及体内肿瘤生长且受缺氧诱导

  缺氧处理PPBP沉默细胞后，采用乳酸检测试剂盒测定胞内乳酸水平、ECAR试剂盒检测胞外酸化速率反映糖酵解水平；构建颅内原位荧光素酶裸鼠移植瘤模型，活体成像监测肿瘤生长并绘制小鼠生存曲线；Western blot检测EMT标志物（Vimentin、Snail、Twist）及乳酸代谢蛋白 LDHA、MCT4，同时设置外源性PPBP回补实验验证表型可逆；梯度缺氧刺激细胞，Western blot动态检测 HIF-1α与PPBP蛋白表达变化，综合代谢检测、动物造模、蛋白免疫印迹证明缺氧诱导PPBP并驱动糖酵解与间质转化

6、HIF-1α转录激活PPBP并介导下游PI3K/Akt信号通路活化

借助JASPAR数据库预测PPBP启动子HRE结合位点；采用ChIP实验结合qPCR验证缺氧下HIF-1α可结合PPBP启动子；构建野生型与HRE突变型PPBP启动子双荧光素酶报告质粒，双荧光素酶实验验证HIF-1α转录激活效应；依据PPBP表达中位数分组，对TCGA数据做差异分析并富集通路；缺氧下沉默PPBP并添加外源PPBP回补，Western blot 检测PI3K、Akt、mTOR总蛋白及磷酸化水平，结合染色质免疫共沉淀、双荧光素酶、通路蛋白检测明确上下游调控轴。

7、Co-IP验证PPBP通过特异性受体CXCR2发挥促癌作用

缺氧培养胶质瘤细胞后提取总蛋白，分别使用PPBP、CXCR2、CXCR1特异性抗体开展Co-IP共免疫沉淀实验，Western blot检测复合物内互作蛋白；采用CXCR2特异性拮抗剂SB225002预处理细胞，设置外源PPBP回补分组，Western blot检测PI3K/Akt通路磷酸化蛋白，依靠蛋白互作与受体阻断功能实验证实PPBP仅结合CXCR2并依赖该受体激活下游促癌通路。

8、虚拟筛选确定靶向PPBP的天然小分子Oenothein B

基于PPBP蛋白晶体结构，采用KarmaDock、AutoDock双重分子对接对多化合物库开展大规模筛选，根据结合打分筛选候选物质并展示化学结构；采用Biacore系统开展SPR表面等离子共振实验，测定Oenothein B等化合物与重组PPBP的结合动力学常数KD；使用PyMOL可视化Oenothein B与PPBP蛋白口袋2D、3D结合构象，整合分子对接、SPR亲和力检测完成靶向药物初筛。

9、体外、体内双重验证Oenothein B靶向PPBP抑制胶质瘤进展

缺氧条件下用Oenothein B处理U87、U251细胞，设置外源PPBP rescue组，依次完成CCK-8、EdU、划痕、Transwell实验检测增殖迁移侵袭；检测胞内乳酸、ECAR评价糖酵解水平，Western blot检测PI3K/Akt通路、EMT、乳酸代谢相关蛋白；构建颅内荷瘤裸鼠，每日灌胃给予Oenothein B，活体成像追踪肿瘤负荷并记录小鼠生存期，多套细胞功能、代谢检测、蛋白印迹与动物干预实验共同证明Oenothein B可结合PPBP阻断下游促癌信号，抑制缺氧诱导胶质瘤恶性表型。